Измерение констант диссоциации комплексов аутоантител с исходной и обогащенными 2'-F-модифицированными РНК-библиотеками было проведено в соответствии с протоколами (п. 2.3.9.). Первоначально нами было проведено “пробное” измерение Kd комплексов аутоантител с исходной 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой согласно протоколу Исходя из полученных данных, была определена область концентраций аутоантител, в которой происходит диссоциация их комплекса с исходной 2'-F-модифицированный РНК-библиотекой, и проведено повторное измерение Kd данного комплекса. Аналогичным образом было проведено измерение Kd комплексов аутоантител с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой после 6-го и после 10-го раундов отбора. Данные, использованные для расчета Kd комплексов аутоантител и 2'-F-модифицированных РНК-библиотек (табл. 4), описывали приведенным ниже уравнением :
f = С·(Kd + + - ((Kd + + )2 - 4··)0.5)/(2·),
где - концентрация аутоантител; - концентрация 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки; f - доля связавшихся олигонуклеотидов; Kd - константа диссоциации комплексов 2'-F-РНК с аутоантителами; С - константа эффективности связывания комплексов аутоантител и 2'-F-олигорибонуклеотидов с нитроцеллюлозными фильтрами.
Используя полученные данные, находили константу С. Отношение f/С давало fнорм - нормированное значение доли комплексов 2'-F-РНК с аутоантителами. Нормированные данные описывали тем же уравнением, принимая С равной 1, и находили Kd (табл. 5).
Таблица 4. Расчетные данные для измерения Kd комплексов аутоантител и 2'-F-модифицированных РНК-библиотек: 1) исходной; 2) после 6-го раунда отбора; 3) после 10-го раунда отбора.
) 2) 3)
| , нМ | f, % | fнорм, % | ||||
| 12000.0 | 36.6 | 100.7 | ||||
| 6000.0 | 40.6 | 93.8 | ||||
| 3000.0 | 34.1 | 85.7 | ||||
| 1000.0 | 31.2 | 77.6 | ||||
| 330.0 | 28.2 | 48.6 | ||||
| 110.0 | 17.7 | 31.1 | ||||
| 37.0 | 11.3 | 30.4 | ||||
| 4.1 | 11.0 | 22.1 | ||||
| , нМ | f, % | fнорм, % | ||||
| 1800 | 60.0 | 68.2 | ||||
| 600 | 86.6 | 98.4 | ||||
| 200 | 93 | 121.1 | ||||
| 66 | 29.9 | 37.9 | ||||
| 22 | 4.3 | 5.4 | ||||
| 7.4 | 4.2 | 5.3 | ||||
| 2.4 | 2.5 | 3.2 | ||||
| 0.8 | 2.2 | 2.9 | ||||
| 0.3 | 2.1 | 2.7 | ||||
| , нМ | f, % | fнорм, % | ||||
| 600 | 86,3 | 87,7 | ||||
| 200 | 110,0 | 111,7 | ||||
| 66 | 85,9 | 87,2 | ||||
| 22 | 69,4 | 70,5 | ||||
| 7,4 | 30,9 | 31,4 | ||||
| 2,4 | 25,6 | 26,0 | ||||
| 0,8 | 17,8 | 18,1 | ||||
| 0,3 | 3,5 | 3,6 | ||||