Сайтспецифическое расщепление гибридного белка TEV протеазой
К концентрату добавили экстракт тел включения TEV до соотношения фермент-субстрат 1:100 и дитиотриэтол до 1мМ, инкубировали 15 часов при 37o С.
Создание штамма продуцента Origami (DE3)/pCBD-VEGF165
Нуклеотидную последовательность кодирующую хитин-связывающий домен (CBD) амплифицировали с pTWIN1. Амплификацию проводили по ранее описанной методике с парой праймеров (T7 прим - прямой, CBD1-обратный). Очистка ПЦР-продукта осуществлялась с помощью набора MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, #27106).
К раствору, содержащего 0,5 мкг плазмиды pET-32b(+) добавили 4 мкл 10Чбуфера Tango, 4 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестриции Xba I и Bgl II. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы Евроген согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0,5 мкг линеаризованного фрагмента плазмиды pET-32b(+) добавили 5 мкл раствора, содержащего 1 мкг амплифицированного гена CBD, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4 оС в течении 15 часов. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli Origami. И из отобранного клона выделили плазмиду pET-CBD.
К 10 мкл раствора, содержащего 0,2 мкг плазмиды pET-CBD и 0,5 мкг амплифицированного гена hVEGF165 фланкированного Xho I и Bgl II сайтами рестрикции добавили 4 мкл 10Чбуфера Tango, 4 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестриции Xho I и Bgl II. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы Евроген согласно протоколу производителя. К 15 мкл экстракта, содержащего 0,2 мкг линеаризованного фрагмента плазмиды pET-CBD и 0.5 мкг амплифицированного гена hVEGF165 добавили 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4оС в течении 15 часов. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli Origami. Из отобранных клонов выделяли плазмидную ДНК набором фирмы QIAGEN. В результате получили экспрессионную плазмиду pCBD-VEGF 165, в качестве штамма носителя использовали E. coli Origami (DE3).
Культивирование штамма Origami (DE3)/pCBD-VEGF165
Плазмидой pCBD-VEGF165 трансформировали компетентные клетки E. coli Origami. 300 мл клеточной суспензии перенесли в питательную среду LB объёмом 25 мл содержащую ампицилин (100мкг/мл) и инкубировали при 37 оС на шейкере при 200об/мин в течение 16 часов. Ночную культуру объёмом 25 мл рассадили в 250 мл питательной среды SOB, содержащей ампицилин (100 мкг/мл) и инкубировали при 37оС до оптической плотности культуральной среды 0,8 ед. После чего добавляли ИПТГ до конечной концентрации последнего 100мкг/мкл. Инкубировали в течение 16 часов при 30о С.
Выделение и очистка гибридного белка CBD-hVEGF165
Биомассу штамма E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF165 (1 г.) гомогенизировали в 15 мл буфера (50 мМ ТрисHCl, 5мМ ЭДТА, 2 М мочевины, 0,2% PMSF, pH 10.0) и лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора (15 с, амплитуда 40%) во льду в течении 30 минут. После дезинтеграции лизат центрифугировали в течение 30 мин (15000g, +4oC). Суммарное содержание белка в полученном супернатанте составило 107 мг. Концентрацию белка определяли методом Бредфорд по стандартному раствору БСА. Осветлённый лизат объёмом 15 мл разбавили раствором 2 М мочевины до 30 мл и нанесли со скоростью 1 мл/мин на колонку HiTrap Heparin Sepharose (5 мл) предварительно уравновешенную буфером А (20 мМ Трис HCl, 1 мМ ЭДТА, 2 М мочевины, pH 8.5). Элюировали в течении 50 мин градиентом буфера Б (20 мМ ТрисHCl, 1 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, pH 8.5) 0% до 100% со скоростью 1,5 мл/мин. Фракции анализировали методом SDS-электрофорезом. Фракции, содержащие ГБ, были объединены. Количество гибридного белка составило 19,31 мг. Перейти на страницу: 1 2 3 4