2) гибридизации искусственно синтезированных олигонуклеотидов с фланговыми участками цепей амплифицируемого фрагмента ДНК (так называемых «праймеров» или «затравочных» фрагментов);
) синтеза (достройки) цепи фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы.
Многократное удвоение цепей ДНК (30-40 циклов) позволяет в течение нескольких часов умножить (амплифицировать) специфический участок ДНК в геометрической прогрессии, а затем идентифицировать его (при электрофорезе в агарозном геле в присутствии красителя бромидэтидия синтезированный фрагмент ДНК выявляется в виде светящейся под действием ультрафиолета полосы) (Вишневская, 1998).
Высокая чувствительность (теоретически возможно определять единичные М.tuberculosis в образце) и быстрота проведения анализа (1-2 дня) чрезвычайно ценны для клинической практики. Метод эффективен в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью (в том числе L-форм), определение которых требует длительного культивирования и сложныхпитательных сред. Однако метод не позволяет определять степень жизнеспособности выявляемых микобактерий.
Метод ПЦР перспективен для дифференциации М.tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий (в том числе и после культивирования микобактерий, особенно на жидких питательных средах с использованием систем типа ВАСТЕС) и для быстрого определения лекарственной устойчивости. Штаммовая идентификация М.tuberculosis позволяет определять внутривидовые различия возбудителя туберкулеза и представляет интерес для эпидемиологических исследований и определения роли суперинфекции при рецидивах туберкулеза. Проблема специфичности ПЦР в диагностике туберкулеза обусловлена высоким риском ложноположительных результатов, поскольку продукты амплификации (фрагменты ДНК) легко могут попасть в исследуемые образцы и служить матрицей для новых реакций. Это определяет очень жесткие требования к технологии проведения анализов, в том числе - раздельные помещения для каждой из трех стадий анализа. Проблема может быть решена за счет инактивации загрязняющих молекул специальными реагентами и совершенствования технологии подготовки клинических образцов (выделение ДНК на микропористых частицах стекла, иммуномагнитная сепарации микобактерий и проч.).
Использование методов, основанных на амплификации фрагментов генома микобактерий (ПЦР), допускается как дополнительный метод ускоренной дифференциальной диагностики туберкулеза при обязательном параллельном применении классических микробиологических методов (Вишневская, 1998). Перейти на страницу: 3 4 5 6 7 8