Как ранее было отмечено в обзоре литературы, одной из важнейших стадий отбора аптамеров является стадия отделения комплексов олигонуклеотидов с молекулой-мишенью от несвязавшихся молекул (п. 1.1.). Способ отделения комплексов от несвязавшихся молекул в первую очередь определяется свойствами мишени. В качестве мишени для создания аптамеров нами были выбраны поликлональные аутоантитела класса G, вырабатываемые организмом человека, больного рассеянным склерозом. Использование в качестве мишени поликлональных аутоантител повышает вероятность получить модифицированные РНК-аптамеры, способные связывать аутоантитела к ОБМ у большинства больных рассеянным склерозом. Поликлональные аутоантитела класса G были выделены из 10 образцов сыворотки крови больных рассеянным склерозом и хроматографически разделены на 2 фракции по сродству к ОБМ в Лаборатории ферментов репарации ИХБФМ СО РАН Безугловой А.М. Для отбора РНК-аптамеров была использована фракция аутоантител с меньшим сродством к ОБМ.
На основе литературных данных в качестве метода разделения комплексов и несвязавшихся молекул нами была выбрана нековалентная иммобилизация АТ на стенках ПЦР-пробирки с последующей промывкой буфером (п. 1.1.). В этом случае образование комплексов олигонуклеотидов с белком-мишенью и все реакции стадии амплификации проводят в одной ПЦР-пробирке. Такой метод отбора гарантирует наличие всех связавшихся с белком-мишенью олигонуклеотидов. Как и в случае ковалентной иммобилизации мишени, при адсорбции антител возможно связывание их активных центров со стенками ПЦР-пробирки. Однако те сайты, что были закрыты для связывания с комбинаторной библиотекой в первом раунде, могут быть доступны в следующем раунде отбора, при этом количество белка-мишени для одного раунда отбора существенно меньше, чем в случае ковалентной иммобилизации мишени.
С использованием данного подхода ранее был получен ДНК-аптамер к иммуноглобулину C595 Нами было решено использовать этот подход для получения РНК-аптамеров.
Иммобилизацию поликлональных аутоантител класса G на стенках ПЦР-пробирки и связывание с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой проводили по аналогии с протоколом
Для получения РНК-аптамеров в процедуру SELEX, описанную в протоколе , необходимо было добавить стадии обратной транскрипции и транскрипции, а также подобрать условия разрушения комплексов антител со связавшимися 2'-F-модифицированными олигорибонуклеотидами. Было апробировано два метода. Количество 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки в обоих случаях составило порядка 450 пмоль. В первом варианте комплексы аутоантител с олигонуклеотидами разрушали добавлением 7 М мочевины с последующей экстракцией смесью Tрис-HCl (pH 8.0): хлороформ:фенол (1:2:5) и осаждением этанолом. Полученную 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку использовали в реакции обратной транскрипции Во втором случае комплексы 2'-F-РНК и аутоантител разрушали инкубированием при 90ºС в течение 2 мин в присутствии 3'-праймера dm 29. Полученный дуплекс использовали в реакции обратной транскрипции. После проведения всех реакций стадии амплификации было получено 226 пмоль и 233 пмоль 2'-F-РНК для 1-го и 2-го случаев, соответственно. Поскольку второй вариант намного быстрее, далее мы придерживались его (рис. 14).
Рис. 14. Схема отбора 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров к поликлональным аутоантителам класса G , вырабатываемым организмом человека при рассеянном склерозе.
Таким образом, нами была разработана и апробирована методика отбора 2'-F-модифицированных РНК-аптамеров к поликлональным аутоантителам человека, больного рассеянным склерозом.
По разработанной методике первоначально было проведено минимальное количество раундов отбора - 6 раундов. На первый раунд был взят 1 нмоль 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки. Для повышения аффинности полученной после 6-го раунда SELEX 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки были проведены еще 4 раунда SELEX с ужесточением условий отбора. Для предотвращения отбора аптамеров к какому-либо компоненту используемых буферов перед каждым раундом отбора был проведен “негативный” SELEX (п. 2.3.7.). Время инкубирования 2'-F-РНК с ПЦР-пробиркой увеличивали от 20 мин до 35 мин с интервалом в 5 мин. Несвязавшиеся с компонентами буфера молекулы 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки использовали в следующем раунде SELEX. Время инкубирования 2'-F-РНК с аутоантителами составило 60, 50, 40 и 30 мин для 7-го, 8-го, 9-го и 10-го раундов SELEX, соответственно. Перейти на страницу: 1 2 3