К сожалению, применить метод бело-голубой селекции для полученных колоний оказалось невозможным, поскольку колония-контроль была такого же светло-голубого цвета, как и большинство полученных колоний. Это может быть связано с тем, что длины ДНК фракций I, II и III было недостаточно для того, чтобы сбить рамку считывания β-галактозидазы. Поэтому наличие плазмидной ДНК в колонии клеток E.coli определяли методом ПЦР. Для этого были использованы 5'-праймер seq 1 и 3'-праймер seq 2, комплементарные 3'- и 5'- константным районам вектора pUC18, фланкирующим ПЛУ (рис. 21).
'-константный район ПЛУ pUC18 5'-константный район ПЛУ pUC18
'-AAAGGGTCAGTGCTGCAACATTTTGC-5' 3'- GGACACACTTTAACAATAGGCGA-5'
5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3' 5'-CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT-3
'-праймер seq 1 3'-праймер seq 2
Рис. 21. Комплексы 5'-праймера seq 1 с 3'-константным районом, фланкирующим ПЛУ вектора pUC18, и 3'-праймера seq 2 с 5'-константным районом, фланкирующим ПЛУ вектора pUC18.
В качестве примера на рис. 22 приведена электрофореграмма реакционных смесей ПЦР для колоний клеток E.coli, трансформированных плазмидной ДНК, содержащей дцДНК фракции I.
Фракция I
pUC18контр. к1 к2 к3 к4 к5
Рис. 22. Электрофоретический анализ реакционных смесей ПЦР для колоний E.coli с плазмидной ДНК фракции I (фракция I, к1, к2, к3, к4, к5 - ПЦР-продукт соответствующих колоний клеток E.coli). В качестве контроля использовали ПЦР-продукт вектора pUC18 (pUC18 контр.). Визуализация полос окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.
Многокопийную плазмидную ДНК выделяли из индивидуальных колоний клеток E.coli с помощью набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) и проверяли наличие дцДНК фракций I, II и III повторно (рис. 23).
Фракция I
к3 к2 к1 pUC18контр.
Рис. 23. Электрофоретический анализ реакционных смесей ПЦР для плазмидных ДНК, содержащих дцДНК фракции I (фракция I, к1, к2, к3 - ПЦР-продукт плазмидных ДНК соответствующих колоний клеток E.coli). В качестве контроля использовали ПЦР-продукт вектора pUC18 (pUC18 контр.). Визуализация полос окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.
Как видно из электрофореграмм на рис. 22 и рис. 23, полученные ПЦР-продукты обладали меньшей электрофоретической подвижностью, чем контрольный ПЦР-продукт, что связано с наличием вставки ДНК фракции I. Однако практически все ПЦР-продукты обладают разной электрофоретической подвижностью, что может быть связано с потерей части ДНК вставки, встраиванием в вектор pUC18 двух и более молекул ДНК фракций или рекомбинацией двух и более молекул ДНК фракций в составе разных плазмидных ДНК.
Для определения нуклеотидной последовательности ДНК-клонов полученные плазмидные ДНК секвенировали с использованием набора Big Dye Terminators v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) в ЦКП “Секвенирование ДНК” СО РАН. Нуклеотидные последовательности полученных клонов ДНК фракций I, II и III приведены в табл. 6.
Таблица 6. Нуклеотидные последовательности ДНК-клонов фракций I, II и III
| Плазмидная ДНК | Нуклеотидная последовательность |
| Фракция I клон 1 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCACGGTAGCGAGGTGCTCTCATTGGGAAGTTTG GGTTGAGACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция I клон 2 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCCCAGGCTACACGCATGTTGATTCTGATGATCG CGCGAGTCGTCTGGCCACGGAGTTTAGGTTCCATGTTTCCGCTGTATGACGATCCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция I клон 3 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGGCAGCACCCGAACGAGAGCGCGAGACTGAGG ATTGCCCTCCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция I клон 4 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGCGGCAGGATCAGGAATTGATTAGAAGTTCTTA CTCCGTTCCGCATCGTCCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCAGTCCTCACCGCATCGTCCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция II клон 1 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGCACGGGCAGGGGATACGAGTGACGTTGGCGT CAACACTACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция II клон 2 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCAGGGGAGAGGATAATGTTCAGCTAGACCGGG CTTCAATCCCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция II клон 3 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCACACACAGGCAACAAACTGTGTCGCGCGAGT CGTCTGTGGGTAAACGAGGGTGGGGCAGAGATGTACTCAGAAAACACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция II клон 4 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGCGACACGTGGCATGACGAGGTTAATCGCGCG AGTCGTCTGCACGATAGTGGTGAGGCCGGGGCATGTGTGGGTATGCTTAACCGCATCGTCCTCCC - 3' |
| Фракция II клон 5 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCACACACAGGCAACAAACTGTGTCGCGCGAGT CGTCTGCAGGGTGAACAAGGGTGGGGCAGAGATGTACTCAGAAAACACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция III клон 1 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGCACGATCGCAGCATTTGGCAACACTGGTCGC GCGAGTCGTCTGGGCATAATGAGCCACAGGTTGGAAGTATTGCTTCACTTGGCCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция III клон 2 | 5'- GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGGGAGGGCGAGTCGTCTGGCTCGAGCTAGGCT GTGCATTCGCAACCACTCACATCGAACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция III клон 3 | 5'- GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGGCACGCGGAAAGACGACGAGCCGTGGCATCG TAGCTCAACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция III клон 4 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGGGGATGAGCGTTGTTACACGCATCATCGCGCG AGTCGTCTGGGGAGGGGAGTAGCTTTTCCGATGGAGACTGAATGCTCCACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция III клон 5 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCACACACAGGCAACACCATGTGTCGCGCGAGT CGTCTGGCGGGGGCCGCGGCAGGCATGAACGATGCAACTCATCAGACCGCATCGTCCTCCC- 3' |
| Фракция III клон 6 | 5'-GGATCCTCGCGCGAGTCGTCTGCGGGTAAACAAGGGTGGGGCAGAGATGTACT CAGAAAACACCGCATCGTCCTCCC- 3' |