Определение количества белка в тканях по методу Лоури
Принцип метода: Метод основан на способности циклических аминокислот - триптофана и тирозина, а также полипептидных цепей в комплексе с медью восстанавливать реактив Фолина. При восстановлении жёлтая окраска реактива переходит в синий цвет.
Реактивы:
1. 2% раствор Na2CO3 в 0.1 N NaOH. После приготовления фильтруется через стеклянный фильтр.
20 г. Na2CO3 развести в 1000 мл дистиллированной воды;
2. 1% раствор CuSO4·5H2O и 2% раствор сегнетовой соли - Na- K-тартрата /Na2C4H4O6 или K2C4H4O6/ смешивают как 1:1.
3. Реактив Фолина: 100 г. вольфрамата натрия /Na2WO4·2H2O/ и 25 г. молибдата натрия /Na2MoO4·2H2O/ растворяют в 700 мл дистиллированной воды. К раствору добавляют 50 мл 80% раствора фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. К колбе присоединяют обратный холодильник и смесь кипятят в течении 10 часов. После чего в колбу добавляют 150 г 50 мл дистиллированной воды и 3-5 капель брома /Br2/. Смесь кипятят без холодильника 15 мин под тягой для удаления избытка брома. Затем смесь охлаждают до комнатной температуры,доводят до объёма 1л, и фильтруют через стеклянный фильтр и хранят в тёмном стекле с притёртой пробкой. Полученный раствор должен быть ярко-жёлтого цвета. Перед работой определяют концентрацию кислоты в полученном растворе. Для этого реактив титруют 1 N NaOH по фенолфталейну: 1 мл реактива Фолина ,250 мл дистиллированной воды,5-10 капель 1% фенолфталейна и титруют
1 N NaOH до розовой окраски.
4. Физиологический раствор. 0.09г NaCl развести в 100 мл дистиллированной воды.
5. 0.15 М КСl 10 мл.
- 0.112 г КСl
- 9.888 мл дистиллированной воды.
6. 7 % раствор трихлоруксусной кислоты.
7. 0.1 N NaOH 100 мл.
. Реактив А: 1 мл реактива 2 смешать с 50 мл реактива 1.
. Рабочий раствор альбумина: 1 мл которого содержит 10 мг белка.
Методика определения белка в тканях.
Животное декапитируем, извлекаем печень, промываем физиологическим раствором и просушиваем фильтровальной бумагой. Навеску ткани 100 мг гомогенизируем в 4 мл 0.15М КСl. Отобрать 0.5 мл гомогената, развести дистиллированной водой в соотношении 1:2 и перемешать. Отобрать 0.1 мл разведённого гомогената, добавить 0.4 мл 7 % ТХУ и центрифугировать 5 мин при 1500 обор/мин. Осадок растворить в 0.1 N NaOH, добавляя его до объёма 0.1 мл. Затем добавить 9 мл реактива А и опять перемешать. Дать постоять 10 мин при комнатной температуре. Прилить 0.9 мл реактива Фолина и опять перемешать. После чего оставить пробы при комнатной температуре на 1 час. Затем колориметрировать против холостой пробы на ФЕКе при красном светофильтре с длиной волны 540-750 нм и длиной оптического пути 1 см.
Холостую пробу готовят следующим способом: в пробирку отмерить 9.1 мл реактива А, добавить 0.9 мл реактива Фолина и тщательно перемешать.
Количество белка в пробе определить при помощи калибровочного графика. Для построения графика используют водный раствор кристаллического альбумина сыворотки быка.
Из этого раствора готовят ряд разведений следующим способом согласно схеме:
| Исходный раствор белка,мл | Дистиллированная вода,мл | Концентрация белка,мкг/мл | 0.1 мл содержит белка в мкг |
| 0.1 | 0.9 | 1000 | 100 |
| 0.2 | 0.8 | 2000 | 200 |
| 0.3 | 0.7 | 3000 | 300 |
| 0.4 | 0.6 | 4000 | 400 |
| 0.5 | 0.5 | 5000 | 500 |