Если же индивидуальный «зонд» недоступен, то применяют методы, которые из большого числа рекомбинантов (106) позволяют выбрать сравнительно небольшую группу (около 102), включающую рекомбинант с искомым геном. Эта группа подразделяется на подгруппы (например, на 10) по 10 рекомбинантов. Из каждой подгруппы выделяется ДНК, которую используют для синтеза мРНК и последующей трансляции ее с целью обнаружения соответствующего продукта искомого гена.
Трансляция мРНК может быть осуществлена в бесклеточной системе. Однако в случае эукариотических генов мРНК часто переносят в ооциты лягушки (ксенопуса) с помощью техники микроинъекции, где она транслируется. Продукт трансляции обычно обнаруживают с помощью антител.
Далее в подгруппе, где обнаружен искомый ген, тем же методом исследуется каждый клон.
При наличии зонда с чашки Петри, на которой выращены колонии клеток, делается отпечаток (реплика) на нитроцеллюлозном фильтре. Клеткам дают вырасти на фильтре, затем их разрушают, подвергают ДНК щелочной денатурации и фильтр прогревают при 80°С, после чего ДНК необратимо с ним связывается. Фильтр отмывают от примесей и обрабатывают радиоактивным «зондом» в условиях, оптимальных для ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизации. После удаления избытка «зонда» методом ауторадиографии определяют положение клеточного клона, содержащего участок ДНК с нуклеотидной последовательностью, комплементарной «зонду». Этот клон становится затем источником клеток для получения искомого гена или его фрагмента.
Для селекции клонов, несущих необходимый ген, достаточно широко применяются и иммунологические методы. Принцип отбора на первых этапах тот же, что и при использовании ДНК- и РНК-зондов. Далее с колоний с рекомбинантными ДНК делается реплика с помощью полимерной пластинки, на которой закреплены антитела к продукту искомого гена. Положение клонов, вырабатывающих этот белок, определяется также с помощью антител, но уже меченных радиоактивным йодом (125I). Перейти на страницу: 1 2 3 4