Как видно из табл. 1, выбор метода отбора определяется особенностями мишени и свойствами, которыми должен обладать аптамер. Так, например, TECS-SELEX используется для отбора аптамеров к мишеням-рецепторам, а Covalent SELEX применяют для получения аптамеров, ковалентно связывающих молекулы-мишени.
Одной из важнейших стадий отбора аптамеров является стадия отделения комплексов олигонуклеотидов с молекулами-мишенями от несвязавшихся молекул. Все способы отделения комплексов от несвязавшихся молекул можно разделить на две группы.
I. Методы, основанные на иммобилизации белка-мишени:
1. ковалентная иммобилизация (белок ковалентно связывают с аффинным сорбентом, например, N-гидроксисукцинимид-активированной сефарозой , Ni-NTA аффинной смолой и др.);
. нековалентная иммобилизация (белок иммобилизуют за счет сил адсорбции на ПЦР-пробирке , гидрофобных парамагнитных шариках , магнитных шариках , нитроцеллюлозе , стрептавидиновых “шариках” в случае биотинилированных белков-мишеней , модифицированной сефарозе Иногда в белок-мишень вводят модификации, способствующие лучшей адсорбции ).
Для отделения несвязавшихся молекул от иммобилизованных комплексов проводят отмывку буфером. В случае использования магнитных шариков для разделения комплексов и несвязавшихся молекул применяют магнитное поле.
II. Методы, не использующие иммобилизацию белка-мишени:
разделение комплексов и несвязавшихся молекул методом электрофореза в геле или в капиллярах в неденатурирующих условиях.
Каждый метод разделения комплексов и несвязавшихся молекул имеет свои преимущества и недостатки. Гель-электрофорез является самым доступным из вышеперечисленных методов. Однако, при его использовании часть комплексов, а, следовательно, и аптамерных последовательностей, остается в геле, то есть теряется. Электрофорез в капиллярах позволяет использовать для отбора малое количество мишени - десятки-сотни пмоль, но при этом необходимо учитывать электрофоретическую подвижность мишени, ее адсорбционные свойства и др. Ковалентная иммобилизация белка-мишени позволяет многократно использовать одну и ту же колонку для отделения несвязавшихся молекул от комплексов. Однако метод обладает рядом недостатков: 1) для иммобилизации необходимо большое количество белка-мишени; 2) в ходе отбора самые прочные комплексы комбинаторной библиотеки и мишени могут оставаться неразрушенными, что приводит к потере искомых аптамерных последовательностей; 3) в ходе иммобилизации белка-мишени существует вероятность связывания его каталитического центра с носителем, что препятствует отбору аптамеров-ингибиторов. Наиболее приемлемым из всех способов отделения комплексов белков-мишеней с комбинаторной библиотекой от несвязавшихся молекул является нековалентная иммобилизация. Инкубирование мишени с комбинаторной библиотекой с последующей иммобилизацией на нитроцеллюлозных фильтрах гарантирует доступность для связывания всей поверхности белка-мишени. Однако доля элюируемых с фильтров олигонуклеотидов составляет 50-80%. Другим методом нековалентной иммобилизации является адсорбция белка-мишени на парамагнитных шариках или стенках ПЦР-пробирки. В первом случае для разрушения образовавшихся комплексов мишени и комбинаторной библиотеки используют специальные элюенты. Во втором случае для разрушения комплексов применяют термическую денатурацию, что позволяет проводить образование комплексов олигонуклеотидов с белком-мишенью и все реакции стадии амплификации в одной ПЦР-пробирке.
В ходе отбора могут быть использованы последовательно несколько различных методов отделения комплексов от несвязавшихся молекул, что позволяет выделить последовательности с максимальным сродством к молекуле-мишени
В процессе SELEX олигонуклеотиды могут также связываться с молекулами - “не мишенями”. Для исключения таких олигонуклеотидных последовательностей применяют “негативный” SELEX Комбинаторную библиотеку инкубируют в условиях образования комплекса с мишенью, но без белка-мишени. Несвязавшиеся молекулы амплифицируют и используют в следующем раунде отбора. При этом “негативный” SELEX может проводиться как до, так и после раунда отбора аптамера к молекуле-мишени.
Не менее важным, чем способ отделения комплексов от несвязавшихся молекул, является выбор условий проведения отбора аптамеров к белковым мишеням. Отбор должен проводиться в тех условиях, в которых впоследствии будет использоваться аптамер. Так, например, для дальнейшего использования аптамера in vivo оптимальными будут считаться условия, наиболее близкие к физиологическим. Перейти на страницу: 1 2 3