Твердофазный фосфитамидный синтез комбинаторной библиотеки олигодезоксирибонуклеотидов
Приготовление растворов мономеров
Качество коммерческих препаратов фосфитамидов, используемых в работе, проверяли методом ТСХ в системе этанол:хлористый метилен (5:95). Защищенные дезоксирибофосфитамиды перед работой сушили над Р2О5 при 2-4 мм рт. ст. в течение 1 ч. Количество мономеров рассчитывали, исходя из того, что на каждую стадию конденсации требуется 60 мкл 0.05 М раствора мономера. Для синтеза константных участков комбинаторной оцДНК-библиотеки растворы фосфитамидов готовили из расчета 0.05 г мономера на 1 мл абс. CH3CN. Для синтеза рандомизированного участка комбинаторной оцДНК-библиотеки смешивали все четыре фосфитамида в одном флаконе из расчета 0.05 г dА-CE, 0.045 г dC-CE, 0.059 г dG-CE и 0.042 г dТ-CE на 1 мл абс. CH3CN. К готовым растворам фосфитамидов добавляли молекулярные сита.
Синтез комбинаторной оцДНК-библиотеки
Синтез вели на синтезаторе ASM-800 (“Биоссет”, Россия) в масштабе 0.4 мкмоль (реактор на 50 мкл) твердофазным фосфитамидным методом согласно протоколу, приведенному в табл. 3.
Таблица 3. Протокол операций автоматического фосфитамидного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов
| №п/п | Операция | Реагент | Кол-во мкл /эквивалентов | Время, сек |
| 1. | Промывка | CH3CN | 280 | 11.6 |
| 2. | Промывка | CH2Cl2 | 270 | 9.0 |
| 3. | Детритилирование | 3% DCA в CH2Cl2 | 325 | 120.0 |
| 4. | Промывка | CH3CN | 270 | 10.8 |
| 5. | Промывка | CH3CN абс. | 250 | 10.0 |
| 6. | Конденсация | 0.05 М р-р мономера*, 0.25 M р-р этилтиотетразола в CH3CN абс. | 50 / 12.5 50 / 31 | 250.0 |
| 7. | Промывка | CH3CN | 60 | 1.2 |
| 8. | Кэпирование | CpB (16% N-MeIm в THF) CpA (Ac2O/2,6-лутидин/THF (1:1:8)) | 130 / 1268 100 / 525 | 24.2 |
| 9. | Промывка | CH3CN | 30 | 31.8 |
| 10. | Окисление | 0.02 М I2 в THF / Py / H2O (90:1:9) | 160 / 13 | 66.0 |
| 11. | Повторить п. 1-10 | |||
| 12. | Конец синтеза Повторить п. 1-4 |