'-F-Модифицированную РНК-библиотеку в 100 мкл буфера для связывания (50 мМ Tрис-HCl (pH 7.5), 200 мМ KCl) инкубировали при 90°С в течение 3 мин (микротермостат “Модель 206”). Охлаждали до комнатной температуры, помещали в ПЦР-пробирку с иммобилизованными антителами и инкубировали при комнатной температуре 1 ч. Несвязавшиеся с аутоантителами олигонуклеотиды удаляли. Комплекс иммобилизованных аутоантител с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой промывали 500 мкл промывочного буфера.
Разрушение комплексов аутоантител с 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой. Реакция обратной транскрипции
Вариант 1. В ПЦР-пробирку с иммобилизованными комплексами аутоантител и 2'-F- РНК добавляли 100 мкл 7 М мочевины, 200 мкл смеси Tрис-HCl (pH 8.0): фенол (1:5) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем добавляли 50 мкл бидистиллированной воды и 100 мкл хлороформа, центрифугировали (центрифуга MiniSpin, 14500 об./мин, 15 сек, 20°С) и отбирали водный слой. К нему добавляли 200 мкл смеси Tрис-HCl (pH 8.0): фенол (1:5), 100 мкл хлороформа и центрифугировали (центрифуга MiniSpin, 14500 об./мин, 15 сек, 20°С). К отобранному водному слою добавляли 20 мкл 3М CH3CO2Na (pH 5.2). Олигонуклеотидный материал осаждали 2.5-кратным избытком этанола (п. 2.3.4). Полученный осадок 2'-F-РНК растворяли в 20 мкл бидистиллированной воды. К раствору добавляли 100 пмоль 3'-праймера dm 29, инкубировали при 90°С в течение 2 мин (микротермостат “Модель 206”) и охлаждали до комнатной температуры. Полученный дуплекс 2'-F-РНК и 3'-праймера dm 29 использовали в реакции обратной транскрипции. Синтез кДНК проводили в буфере (50 мкл), содержащем 50 мМ Tрис-HCl (pH 8.0), 8 мM MgCl2, 30 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0.5 мМ dGTP, 0.5 мM dATP, 0.5 мM dCTP, 0.5 мM dTTP, 400 е.а./мл AMV RT, при 37°С в течение 30 мин, затем при 48°С в течение 30 мин (термостатируемый шейкер, BIOER). Полученную кДНК использовали в ПЦР.
Вариант 2. В ПЦР-пробирку с иммобилизованными комплексами аутоантител и 2'-F- РНК добавляли буфер (100 мкл), содержащий 50 мМ Tрис-HCl (pH 8.0), 8 мM MgCl2, 30 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0.5 мМ dGTP, 0.5 мM dATP, 0.5 мM dCTP, 0.5 мM dTTP, 100 пмоль 3'-праймера dm 29, инкубировали при 90°С в течение 2 мин (микротермостат “Модель 206”) и охлаждали до комнатной температуры. К полученной реакционной смеси добавляли обратную транскриптазу AMV до концентрации 400 е.а./мл и инкубировали при 37°С в течение 30 мин, затем при 48°С в течение 30 мин (термостатируемый шейкер, BIOER). Полученную кДНК использовали в ПЦР.
Полимеразная цепная реакция и реакция транскрипции in vitro
С использованием полученной кДНК (вариант 1 или 2) проводили ПЦР в буфере (1000 мкл), содержащем 7.5 мМ MgCl2, 1 мM dGTP, 1 мM dATP, 1 мM dCTP, 1 мM dTTP, 2 мкМ 3'-праймера dm 29, 2 мкМ 5'-праймера dm 28 long, 25 е.а./мл Taq ДНК-полимеразы, 10 мМ Tрис-HCl (pH 8.3), 50 мМ KCl. Реакционную смесь переносили в 10 ПЦР-пробирок на 0.5 мл по 100 мкл реакционной смеси в каждую и помещали в амплификатор Mastercycler gradient.
Амплификацию проводили в следующих условиях: 93°С 3 мин, 93°С 30 сек, 63°С 1 мин, 72°С 1 мин, затем повтор еще 20 циклов, охлаждение до 4°С.
ПЦР-продукт очищали гель-электрофорезом в 12%-ном ПААГ в нативных условиях или с помощью набора “DNA clean & concentrator-25” как описано в п. 2.3.3. Перейти на страницу: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11