Очищенную таким образом дцДНК-библиотеку использовали в качестве матрицы для реакции транскрипции in vitro (п. 2.3.4). Полученную при этом 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку растворяли в бидистиллированной воде и использовали для следующего раунда SELEX.
“Негативный” SELEX
В ПЦР-пробирку на 0.5 мл помещали 100 мкл 0.05 М NaHCO3/Na2CO3 (pH 9.6) и инкубировали при 4°С в течение 16-20 ч. Буфер удаляли, ПЦР-пробирку промывали 4х100 мкл промывочного буфера. Далее в ПЦР-пробирку добавляли 500 мкл блокирующего буфера и инкубировали при комнатной температуре 1 ч, после чего еще раз промывали пробирку 500 мкл промывочного буфера.
'-F-Модифицированную РНК-библиотеку в 100 мкл буфера для связывания инкубировали при 90°С в течение 3 мин (микротермостат “Модель 206”). Затем охлаждали до комнатной температуры, переносили в ПЦР-пробирку и инкубировали при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Буфер с несвязавшимися олигонуклеотидами удаляли и использовали в следующем раунде SELEX.
Введение радиоактивной метки по 5'-концу 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки
Дефосфорилирование. Реакцию дефосфорилирования 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки проводили в буфере (100 мкл), содержащем 0.01 М Tрис-HCl (pH 7.5), 0.01 M MgCl2, 160 пмоль 2'-F-РНК, 120 е.а./мл бактериальной щелочной фосфатазы, при 50°С в течение 1 ч (термостатируемый шейкер, BIOER). Реакционную смесь последовательно экстрагировали смесью Tрис-HCl (pH 7.0):хлороформ:фенол (1:24:25) (100 мкл) и серным эфиром (100 мкл). Полученную дефосфорилированную 2'-F-модифицированную РНК-библиотеку осаждали добавлением 2.5-кратного избытка этанола в присутствии 0.3 М CH3CO2Na (pH 5.2) с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок 2'-F-РНК отделяли центрифугированием (центрифуга Centrifuge 5415 R, Eppendorf, 13000 об/мин, 4°С, 10мин), промывали 75%-ным этанолом, сушили при 2-4 мм. рт. ст. в течение 20 мин и растворяли в бидистиллированной воде.
Введение радиоактивной метки. Введение радиоактивной метки по 5'-концу 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки проводили в буфере (20 мкл), содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 7.6), 10 мМ MgCl2, 5 мМ DTT, 0.1 мМ Na2EDTA, 0.1 мМ спермидин гидрохлорид, 0.1 мКи γ--АТP, 10% (по объему) диметилсульфоксида, 500 е.а./мл полинуклеотидкиназы фага Т4, в течение 2 ч при 37°С (термостатируемый шейкер, BIOER). Затем к реакционной смеси добавляли 5 е.а. полинуклеотидкиназы фага Т4 и инкубировали еще 1 ч при 37°С.
После окончания инкубации к реакционной смеси добавляли равный объем буфера А. -Меченую РНК-библиотеку выделяли гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ. Визуализацию 5'--меченых олигорибонуклеотидов в геле проводили с помощью радиоавтографии на рентгеновскую пленку Agfa (Бельгия). Полосу 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки вырезали из геля, элюировали 0.3 М CH3CO2Na (pH 5.2) и осаждали добавлением этанола как описано выше.
Определение констант диссоциации комплексов 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки с поликлональными аутоантителами
Определение области концентраций аутоантител для измерения Kd
Для определения области концентраций аутоантител, в которой происходит диссоцияция их комплексов с исходной 2'-F-модифицированной РНК-библиотекой, готовили 12 проб аутоантител (20 мкл каждая) в буфере для связывания состава 50 мМ Tрис-HCl (pH 7.5), 200 мМ KCl. Концентрации антител варьировали от 3 мкМ до 17 пМ путем трехкратного разбавления каждой последующей пробы. -Меченую 2'-F-пиримидинсодержащую РНК-библиотеку растворяли в буфере для связывания до концентрации 13 нМ, инкубировали при 90°С в течение 2 мин (микротермостат “Модель 206”) и охлаждали до комнатной температуры. Затем к каждой пробе аутоантител добавляли 80 мкл раствора 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки в буфере для связывания и инкубировали при комнатной температуре в течение 14 ч. В качестве контроля использовали пробу, содержащую 1 пмоль -меченой 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки в 100 мкл буфера для связывания. Перейти на страницу: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12