*-в случае синтеза рандомизированного участка использовали раствор 4-х фосфитамидов в абс. CH3CN.
2.3.2 Деблокирование олигодезоксирибонуклеотидов
Полимер после синтеза (из одного реактора) сушили в вакууме мембранного насоса DOA V130 BN (Waters, США) в течение 2 мин и переносили в пробирку на 0.6 мл. К полимеру приливали 0.3 мл 40 %-ного водного метиламина и выдерживали в течение 15 мин при 65°С и постоянном перемешивании (термостатируемый шейкер Thermomixer compact (Eppendorf, Германия), 14000 об./мин). Затем раствор выдерживали при -20°С в течение 15-20 мин и отделяли от полимера. Полимер промывали 3х100 мкл смеси этанол:ацетонитрил:вода (1:1:1). Растворы объединяли и упаривали до сухого остатка в вакуумном испарителе Speed-Vac (Eppendorf, Германия). Сухой остаток растворяли в 100 мкл воды и измеряли оптическую плотность полученного раствора.
Выделение олигодезоксирибонуклеотидов
Выделение олигодезоксирибонуклеотидов - праймеров
К реакционным смесям после синтеза и деблокирования олигонуклеотидов (п. 2.3.2.) добавляли равный объем денатурирующего буфера А и наносили на 15%-ный ПААГ толщиной 0.8 мм из расчета 3-4 о.е. на карман. После проведения электрофореза олигонуклеотиды в геле визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Учасок геля, содержащий целевой олигонуклеотид, вырезали, заливали 1 мл 0.3 М NaClO4 и перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, Eppendorf, Германия, 400 об./мин). Элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Объединенные элюаты обессоливали на картридже Alltech C 18 (США), промывая колонку сначала 0.05 М водным раствором NaClO4, затем 0.05 М NaClO4 в 50%-ном CH3CN. Растворы олигонуклеотидов упаривали на испарителе SpeedVac (Eppendorf, Германия) до объема 0.1 мл. Олигонуклеотидный материал осаждали добавлением 1 мл 2%-ного NaClO4 в ацетоне с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок отделяли центрифугированием (центрифуга MiniSpin, Eppendorf, Германия, 14500 об./мин, 10 мин, 20°С), супернатант отбирали, осадок промывали ацетоном и высушивали в течение 5 мин при 37°С.
Гомогенность выделенных олигонуклеотидов анализировали гель-электрофорезом в 15%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”.
Выделение комбинаторной библиотеки олигодезоксирибонуклеотидов
К реакционной смеси после синтеза и деблокирования библиотеки олигонуклеотидов (п. 2.3.2.) добавляли равный объем денатурирующего буфера А и наносили на 12%-ный ПААГ толщиной 0.8 мм из расчета 3-4 о.е. на карман. После проведения электрофореза олигонуклеотиды в геле визуализировали в УФ-свете (п. 2.2). Участок геля, содержащий целевой олигонуклеотид, вырезали и заливали 1 мл 2 мМ Na2EDTA в 0.3 М CH3CO2Na (pH 7.8), перемешивали при комнатной температуре в течение нескольких часов (термостатируемый шейкер Thermomixer compact, Eppendorf, Германия, 400 об./мин). Элюат отбирали, гель промывали 1 мл того же раствора. Олигонуклеотидный материал осаждали добавлением 2,5-кратного избытка (по объему) этанола с последующим выдерживанием при -20°С в течение 10-12 ч. Осадок отделяли центрифугированием (центрифуга MiniSpin, Eppendorf, Германия, 14500 об./мин, 10 мин, 20°С), супернатант отбирали, осадок промывали 75%-ным этанолом и сушили при 2-4 мм. рт. ст. в течение 20 мин. Гомогенность выделенной библиотеки анализировали гель-электрофорезом в 12%-ном денатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием геля раствором красителя “Stains-All”. Перейти на страницу: 1 2 3 4 5 6 7