1. колонку Microcon YM-30 помещали в пробирку на 1.5 мл;
2. 500 мкл олигонуклеотидной фракции наносили на колонку;
. центрифугировали пробу 8 мин при 14400 об./мин, 20°С (центрифуга MiniSpin);
. переворачивали колонку и помещали ее в новую пробирку на 1.5 мл;
. центрифугировали пробу 3 мин при 3800 об./мин, 20°С;
. для повторной элюции олигонуклеотидного материала на колонку наносили 10 мкл бидистиллированной воды, колонку переворачивали и помещали в пробирку с 2'-F-РНК библиотекой (п. 5);
. центрифугировали 3 мин при 3800 об./мин, 20°С;
. каждую фракцию 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки (п. 5,7) собирали в одну пробирку на 1.5 мл.
Обессоленную фракцию 2 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки разделили на две части: фракцию I (основная часть фракции 2) и фракцию II (“конечная” часть фракции 2). Обессоленную фракцию 11 обозначили как фракцию III. Фракцию I осадили добавлением 2.5-кратного избытка (по объему) этанола как описано в пункте 2.3.4. Осадок растворили в бидистиллированной воде и хранили при - 20°С. Фракции II и III 2'-F-пиримидинсодержащей РНК-библиотеки после обессоливания амплифицировали как описано в пункте 2.3.5. с целью наработки необходимых количеств фракций 2'-F-РНК.
Получение плазмидной ДНК на основе вектора pUC18 и дцДНК-библиотеки фракций I, II и III
Проверка рестриктазной активности эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII
Проверку рестриктазной аутивности вели на примере вектора pUC18. Реакции гидролиза проводили отдельно для каждой рестриктазы в однократном буфере FastDigest (Fermentas) (10 мкл), содержащем 0.1 пкмоль pUC18, 200 е.а./мл рестриктазы BamHI или 200 е.а./мл рестриктазы HindIII при 37°С в течение 5 мин, а затем при 80°С в течение 10 мин (термостатируемый шейкер, BIOER). Полученные реакционные смеси анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле (п. 2.2.).
Получение дцДНК-библиотеки фракций I, II и III методом ОТ-ПЦР “высокой точности” (high-fidelity)
Обратную транскрипцию фракций I, II и III (п. 2.3.10.) 2'-F-модифицированной РНК-библиотеки проводили, как описано в п. 2.3.5, используя в качестве матрицы 20 пкмоль 2'-F-РНК. Реакционная смесь ПЦР высокой точности (1000 мкл) содержала 1 мМ MgCl2, 50 мкM dGTP, 50 мкM dATP, 50 мкM dCTP, 50 мкM dTTP, 2 мкМ 5'-праймера HindIII, 2 мкМ 5'-праймера BamHI, 25 е.а./мл Taq ДНК-полимеразы, 50 мкл реакционной смеси ОТ, 10 мМ Tрис-HCl (pH 8.3), 50 мМ KCl. Реакционную смесь переносили в 10 ПЦР-пробирок на 0.5 мл по 100 мкл реакционной смеси в каждую и помещали в амплификатор Mastercycler gradient.
Амплификацию проводили в следующих условиях: 93°С 3 мин, 93°С 30 сек, 63°С 1 мин, 72°С 1 мин, затем повтор еще 20 циклов, охлаждение до 4°С.
ПЦР-продукт очищали с помощью набора “DNA clean & concentrator-25” как описано в п. 2.3.5.
Эндонуклеазное расщепление вектора pUC18 и дцДНК-библиотеки фракций I, II и III рестриктазами BamHI и HindIII
Полученную дцДНК-библиотеку каждой фракции подвергали эндонуклеазному расщеплению рестриктазами BamHI и HindIII. Реакцию гидролиза проводили в однократном буфере FastDigest (Fermentas) (50 мкл), содержащем 55 пкмоль дцДНК-библиотеки, 40 е.а./мл рестриктазы BamHI и 40 е.а./мл рестриктазы HindIII, в течение 2 ч 30 мин при 37°С (термостатируемый шейкер, BIOER). Полученную дцДНК-библиотеку с “липкими” концами очищали с помощью набора “DNA clean & concentrator-5” как описано в п. 2.3.5. Перейти на страницу: 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13