Рис. 25. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) в невостанавливающих и восстанавливающих условиях фракций после элюции с гепарин сефарозы. Где A - димер гибридного белка CBD-hVEGF165. B - мономер гибридного белка CBD-hVEGF165.
По результатом электрофореза в невостанавливающих условиях были отобраны фракции для дальнейшей работы.
Полученные фракции были объедены и сконцентрированы методом ультрафильтрацией на мембране YM 30 с целью дальнейшего протеолитического расщепления гибридного белка TEV-протеазой.
Протеолитическое расщепление гибридного белка CBD-hVEGF165 TEV протеазой.
Концентрат нанесли на колонку, заполненную хитиновым сорбентом (New England Biolabs). Колонку заполнили буферным раствором, содержащим TEV протеазу, инкубировали при 37оС на 15 часов. Продукты протеолитического расщепления элюировали буферным раствором А. Элюат и хитиновый сорбент анализировали методом SDS-электрофорезом.
Эффективность ферментативного гидролиза составила менее 50%. В качестве альтернативного пути осуществления протеолитического расщепления ГБ было решено отказаться от предварительной сорбции на хитиновый сорбент, а расщеплять, непосредственно, в растворе. К полученному концентрату добавили экстракт тел включения TEV в соотношении фермент-ГБ 1:100, а также добавили 1М раствор дитиотриэтола до концентрации последнего в реакционной среде 1 мм.
Рис 26. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) результаты протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка на колонке заполненной хитиновым сорбентом. Где A- димер гибридного белка CBD-hVEGF165, B - мономер гибридного белка CBD-hVEGF165, C - hVEGF 165.
Инкубировали в течение 15 часов при температуре 37оС и слабом перемешивании. Гидролиз гибридного белка прошёл, практически, полностью (Рис. 27).
Рис. 27. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ). Кинетика протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка в растворе. Где A - димер hVEGF165, B - мономер гибридного белка CBD-hVEGF165, C - мономер hVEGF165.
Далее смесь, содержащую продукты ферментативного гидролиза, фракционировали, с помощью аффинной хроматографии на сорбенте гепарин сефароза по ранее описанной методики. Фракции содержащие целевой белок очищали с помощью ВЭЖХ на колонке Диасорб С18 (Рис. 28).
Рис. 28 Профиль ВЭЖХ хроматографии на колонке Диасорб С18 фракций, содержащих hVEGF165
hVEGF165 чистотой 98% элюировался с колонки начиная 18,6 мин по 19,1 минуту. Полученный элюат, содержащие чистый rhVEGF165 был лиофилизирован. Итоговый выход целевого белка составил 22,4 мг с литра культуры.
Таблица 3
Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF165 из биомассы E. coli Origami/pCBD-VEGF165.
| Этапы очистки | Общий белок (мг) | Содержание ГБ (%) | Содержание hVEGF165 (%) |
| Осветлённый клеточный лизат | 428 | 15 | |
| Аффинная хроматография на колонке HiTrap Heparin Sepharose | 77,2 | 90 | |
| Концентрирование на мембране YM 30 | 56 | 90 | |
| Расщепление ГБ TEV протеазой | 56 | 76 | |
| Аффинная хроматография на колонке HiTrap Heparin Sepharose | 34 | 90 | |
| ОФ ВЭЖХ | 22,4 | 97 |